超薄切片厚度和干涉色

通常會(huì )向超顯微術(shù)的學(xué)生介紹大家周知的“Peachey圖"。該圖顯示了切片厚度與它們在刀槽中漂浮時(shí)觀(guān)察到的干涉色之間的關(guān)系，并被超微切片機的漫射白光照亮（Peachey，1958)。自從他的第一篇文章以來(lái)，早期的超微計制造商之一lvan Sorvall,lnc.制作了干涉色與切片厚度的圖表，該圖表被其他商業(yè)公司復制，并在電子微鏡實(shí)驗室中變得非常普遍。然而，這張圖表是藝術(shù)家對Peachey的原始數據的再現，并沒(méi)有準確地描繪出現代超微光度計改進(jìn)的照明和設計所看到的顏色。因此，RMC Boeckeler進(jìn)行了一項簡(jiǎn)單的研究，以顯示干涉色，觀(guān)察并拍攝了嵌入常用環(huán)氧樹(shù)脂中的典型生物標本。

使用儀器
本研究使用了The RMC Boeckeler PowerTome。它配備了一個(gè)機械推進(jìn)系統，該系統具有一個(gè)高重復性切割臂推進(jìn)的精密數字線(xiàn)性標尺。這款先進(jìn)的超高倍顯微鏡還配有觸摸屏電腦和帶高清攝像頭的三目立體顯微鏡，用于拍攝切片時(shí)的圖片和視頻。該成像系統還有一個(gè)測量工具，可用于測量切片尺寸和面積，以便與樣品塊表面的尺寸和面積進(jìn)行比較，從而估算切片壓縮量。

程序

將小鼠脾臟固定在4%甲醛和1%戊二醛中，并后包埋在來(lái)自電子顯微鏡科學(xué)公司（EMS，哈特菲爾德，賓夕法尼亞州，美國）的Embed 812樹(shù)脂中。這是一種常用的EPON812替代樹(shù)脂，是許多實(shí)驗室中用于生物標本的環(huán)氧樹(shù)脂混合物的代表。按照制造商的說(shuō)明，使用硬混合物。使用生產(chǎn)PT PCZ超薄切片機進(jìn)行切片。使用Mitutoyo千分尺（型號#ID-C112E)，通過(guò)獨立的方法驗證切割臂的機械前進(jìn)，該測微計（千分尺）可以讀取1um增量的線(xiàn)性距離。使用儀器控制器使切片臂前進(jìn)10 um,并將這些距離與Mitutoyo千分尺在切割臂整個(gè)200um前進(jìn)范圍內的讀數進(jìn)行比較。這兩個(gè)讀數在1%的誤差范圍以?xún)?。切割臂的機械推進(jìn)是通過(guò)步進(jìn)電機和數字線(xiàn)性推（前）進(jìn)系統的反饋控制來(lái)實(shí)現的，因此，超薄切片的較小推進(jìn)預計也同樣準確。例如，100納米步進(jìn)多個(gè)累加增量導致在Mitutoyo千分計上的讀數與1微米和10微米的較大進(jìn)階相同。

在30nm至400nm范圍內切割切片，并在切片時(shí)和在CHCI3蒸汽"拉伸"（減壓）后拍照。設置相機的增益和曝光設置，使得生成的圖像與通過(guò)立體顯微鏡直接觀(guān)察到的顏色和亮度緊密匹配。使用圖像處理軟件lmageJ（NIH，USA)排列切片圖像，以產(chǎn)生圖2。

結果

RMC Boeckeler PowerTome PCZ穩定而精確的先進(jìn)系統是切片典型環(huán)氧樹(shù)脂包埋標本以記錄切片干涉色的*佳選擇。厚度在70納米和100納米之間的切片的金色的細微變化很容易區分。在170納米附近可以看到明亮的藍色，比Peachey最初在舊儀器上報告的190納米到240納米要薄得多。

圖2顯示了CHCla"拉伸“的切片截面，這是許多實(shí)驗室的準技術(shù)。其他人經(jīng)常使用一種裝置，使加熱的絲經(jīng)過(guò)該部分，以獲得該部分的類(lèi)似減壓。切片的解壓縮有利于改善切片在透射電子顯微鏡（TEM）的光束內拉伸和移動(dòng)的效果。我們發(fā)現，與樣品塊面相比，截面長(cháng)度壓縮了大約10%。在CHClg拉伸后，壓縮減少到約8%。因此，這些部分的實(shí)際厚度可以等效地減小。圖2是由一臺儀器制作的實(shí)際切片構建而成，該儀器被證實(shí)是精確的，為超微切片師提供了更精確和更新的參考，因此比以前由藝術(shù)家制作和商業(yè)發(fā)行的圖表更有用。此圖表還涵蓋了更大的厚度范圍，展示了一些干涉色如何隨著(zhù)切片厚度的增加而重復出現。

參考Peachey,L.D.(1958)J.Biophys。生物化學(xué)Cytol.4,233.

Sjo strand,F.S.(1967)細胞和組織的電子顯微鏡 Electron Microscopy of Cells andTissues281-287。